薄层色谱化合物定量分析通常采用光密度扫描法(densitometry)。由氘灯、汞灯或卤钨灯光源发出的紫外-可见光经单色器、狭缝及透镜等组成的光路系统进行分光和聚焦后,照射到放置于步进电机驱动平台上的薄层板表面。通过一组光电二极管对折射光或激发光信号进行转换和记录,从而获得不同波长下的化合物浓度信息(图12-47)。
某CCD中感光元件的三原色吸收波长范围及量子效率的示意图。其中绿色采用两个光电二极管结构的PN节半导体感光单元捕获,以兼顾人类对于绿色敏感的视觉特点。Kodak
由于设计原理和工作方式的不同(图12-48),数字成像方式所获得的红绿蓝(RGB)三原色信息所记录的被测物体波长信息没有光密度计所采用的单色器光栅分光法精确。但色彩图像包含了化合物可见光区的全部信息,根据中心极限定理可知,对于每个化合物的测定波长范围越宽,则所获得的数据越接近正态分布,从而理论上可用于图像定量计算。许多基于薄层色谱数字图像的应用实例表明,采用CCD数字图像技术对薄层板上化合物的浓度信息进行定量分析是完全可行的。
CIE1931色彩空间色度图是由国际照明委员会颁布的标准色度系统之一,是颜色测量和表征的国际标准。其采用XYZ三色刺激值的数学公式来定义人类视觉的色域。图中外侧曲线边界是单色光谱轨迹,可作为单色颜色与所代表波长值之间的索引。用于描述人类视觉颜色感知的常用色彩空间或模型有很多种,如LAB、RGB、CMYK、HSV、YUV等。
在ChemPattern中,为了以最有利于数据分析的方式对薄层图像的原始光谱信息进行提取,需要简并或舍弃一些会对分析过程形成干扰的色彩信息。此外,原始的数字图像数据具有3个维度,即RGB值,而为了兼容其它色谱数据的向量格式及方便后续数据处理过程,也需要采用特定算法将RGB值进行加权合并。RGB颜色通道合并算法的通式为:
{V_{Luminance}} = \alpha Red + \beta Green + \gamma Blue其中α、β、γ分别代表三原色的权重值。在色彩空间中,最常见的方式是RGB空间的灰阶转换,从而形成以亮度(Luminance)为单位的单色值。其中最经典的RGB到YUV空间的灰阶计算公式如下:
Y = 0.299Red + 0.587Green + 0.114Blue色彩空间以人类视觉色域作为基础,因此上式计算的亮度值与真实的光强度无关。在ChemPattern中,为了兼容灰度转换计算仍提供该方法,但应理解其与下式的RGB合并方法对于色谱分析而言通常并无本质区别:
Y = 1.0Red + 1.0Green + 1.0Blue此外,在薄层色谱图像分析中采用单色通道扫描可用于改善在灰度通道下图谱扫描效果不佳的情况,例如: